Молекулярное исследование механизмов действия цилостазола на определенные семейства фосфодиэстераз

• Корейба К.А.
• Ступин В.А.
• Силина Е.В.
• Сюзёв К.Н.
• Серебрякова О.А.

Резюме

Цель - изучить действие цилостазола на изоформы мишеней фосфодиэстеразы 3 и фосфодиэстеразы 5 с использованием методов молекулярного моделирования.

Материал и методы. Исследование ингибирования фосфодиэстераз (ФДЭ) выполнялось с помощью методов молекулярного докинга, которые проводились посредством работы с программным обеспечением Maestro Schrodinger Inc. Структура всех указанных белков была взята из PDB (Protein Data Bank): 7L27-ФДЭ3А, 1JOS-ФДЭ3В, 4MD6-ФДЭ5. Структуры лигандов цилостазола и варденафила получены из базы данных PubChem. Режим Glide Docking SP использовался для определения наилучшей позы лиганда в супрамолекулярном комплексе ФДЭ-лиганд с функцией минимальной оценки энергии. Структуры ФДЭ взяты из банка данных по белкам. Каждая молекула ФДЭ подготовлена перед докингом с применением модуля Protein Preparation Wizard. Оптимизация геометрии лиганда осуществлялась с помощью силового поля MMF4 в программном пакете молекулярной динамики GROMACS. Активный центр ферментов считался ригидным, изменение торсионных углов было разрешено для цилостазола. Визуализация результатов выполнена с помощью функции Ligand Interaction в модуле Maestro. Константа ингибирования (Ki) получена из энергии связи (ΔG) по формуле: Ki=exp (ΔG / RT), где R - универсальная газовая постоянная (1,985 × 10⁻³ ккал · моль^{− 1} · K⁻¹); T - температура (298,15 К).

Результаты. Цилостазол обладает большей аффинностью к изоформе ФДЭ3А (Ki=54 nM) по сравнению с ФДЭ3В (Ki=1,13 µM) на основе данных проведенного молекулярного докинга. Также цилостазол способен ингибировать ФДЭ5 в лечебных дозах (Ki=10 µM).

Заключение. Ингибирование цилостазолом изоформы ФДЭ3А в большей степени, чем ФДЭ3В, объясняет низкую частоту побочных эффектов со стороны ингибирования ФДЭ3B в клинической практике. Цилостазол также может ингибировать в лечебных дозах ФДЭ5 (Ki=10 µM), в связи с чем он может оказывать дополнительный терапевтический эффект при лечении перемежающей хромоты, сахарного диабета и его осложнений, в особенности невропатии.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для цитирования: Корейба К.А., Ступин В.А., Силина Е.В., Сюзёв К.Н., Серебрякова О.А. Молекулярное исследование механизмов действия цилостазола на определенные семейства фосфодиэстераз. Ангиология и сосудистая хирургия. 2022; 28 (1): 22-28. DOI: https://doi.org/10.33029/1027-6661-2022-28-1-22-28

Ключевые слова:сахарный диабет; синдром диабетической стопы; хроническая артериальная недостаточность; ингибитор фосфодиэстеразы; цилостазол; молекулярное моделирование

Введение

Сахарный диабет - одна из самых быстро увеличивающихся в масштабе проблема здравоохранения в XXI в. Число взрослых, живущих с сахарным диабетом, возросло в 3 раза за последние 20 лет. Среди потенциально опасных осложнений, существенно ухудшающих качество жизни больных, необходимо отметить синдром диабетической стопы (СДС), который поражает от 40 до 60 млн человек с сахарным диабетом во всем мире [1].

Главным компонентом нарушения каскада обменных процессов и функции органов и систем при сахарном диабете и, в частности, при СДС становится клиническая манифестация ангиопатий и невропатии, как следствие - микроангиопатии. Решающую роль в этом играют отрицательные регуляторы в сигнальном каскаде циклических нуклеотидов - ФДЭ [2].

ФДЭ - суперсемейство ферментов класса гидролаз, которые катализируют гидролиз циклических фосфатных связей циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и/или циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), что приводит к их гидролизу до ГМФ/AMФ. Выделяют 11 структурно связанных, но функционально различных семейств генов фосфодиэстераз (от ФДЭ 1 до ФДЭ 11) [3]. ФДЭ считаются важнейшими регуляторами внутриклеточных концентраций циклических нуклеотидов и циклических нуклеотид-зависимых сигнальных путей [4]. Описаны два подсемейства ФДЭ3 - ФДЭ3A и ФДЭ3B. Изоформы ФДЭ3A и ФДЭ3B обладают высокой структурной гомологией каталитического сайта и очень похожими кинетическими свойствами гидролиза циклических нуклеотидов, но различаются своим расположением в организме. ФДЭ3B в основном экспрессируется в адипоцитах, гепатоцитах и β-клетках поджелудочной железы, тогда как ФДЭ3A чаще экспрессируется в сердце, тромбоцитах, клетках гладких мышц сосудов и ооцитах [5]. Селективные ингибиторы ФДЭ3 широко применяются в клинической практике и представляются наиболее перспективными среди ингибиторов всех других форм ФДЭ в лечении таких осложнений сахарного диабета, как СДС, перемежающая хромота, полиневроостеоартропатия и др. Фермент ФДЭ5 был выделен из тромбоцитов в 1980 г. Однако ФДЭ5 не получил особой известности, пока не было обнаружено, что он является регулятором сокращения гладких мышц сосудов и, что более важно, мишенью для препарата силденафила. Дальнейшее изучение показало, что ФДЭ5 в значительной степени экспрессируется не только в кавернозных телах полового члена, но и во многих других органах, таких как легочные и коронарные сосуды. Симпатическая нервная система и клетки Пуркинье также экспрессируют фермент ФДЭ5, где его функция менее известна. ФДЭ5 напрямую влияет на расширение сетчатки и сосудов хориоидеи (гладкие мышцы и эндотелиальные клетки) [6].

Цель. На основании молекулярной модели изучить действие цилостазола на изоформы мишеней ФДЭ3 и ФДЭ5; результаты молекулярного моделирования использовать для прогнозирования потенциальных клинических эффектов при применении цилосталоза.

Материал и методы

Исследование ингибирования ФДЭ выполнялось с помощью методов молекулярного докинга, которые осуществлялись с использованием программного обеспечения Maestro Schrodinger Inc. [7]. Структура всех указанных белков была взята из PDB (Protein Data Bank): 7L27-ФДЭ3А, 1JOS-ФДЭ3В, 4MD6-ФДЭ5. Структуры лигандов цилостазола и варденафила получены из базы данных PubChem. Режим Glide Docking SP применяли для определения наилучшей позы лиганда в супрамолекулярном комплексе ФДЭ-лиганд с функцией оценки минимальной энергии. Каждая молекула ФДЭ подготовлена перед докингом с помощью модуля Protein Preparation Wizard. Оптимизация геометрии лиганда была проведена посредством силового поля MMF4 в программном пакете молекулярной динамики GROMACS [8]. Активный центр ферментов считался ригидным. Визуализация результатов осуществлена с помощью функции Ligand Interaction в модуле Maestro. Константа ингибирования (Ki) получена из энергии связи (ΔG) по формуле: Ki=exp (ΔG / RT), где R - универсальная газовая постоянная (1,985×10⁻³ ккал · моль^{− 1} · K⁻¹); T - температура (298,15 К) [9].

Результаты

На рисунках представлены графики сравнения энергии связывания (ΔG) цилостазола и двух изоформ ФДЭ3A и ФДЭ3В (рис. 1), а также энергии связывания (ΔG) цилостазола с ФДЭ5 по сравнению с варденафилом - классическим ФДЭ5 селективным ингибитором (рис. 2).

Рис. 1. Сравнение энергии связывания (ΔG) цилостазола с ФДЭ3А (-9,9±0,455 kcal/mol) и ФДЭ3В (-8,1±0,324 kcal/mol)

* p<0,05

Рис. 2. Сравнение энергии связывания (ΔG) цилостазола (-6,8±0,32 kcal/mol) и варденафила (-10,1±0,4 kcal/mol) с ФДЭ5

* p<0,05.

После проведения оценки энергии связывания нами были проанализированы ключевые нековалентные взаимодействия цилостазола, варденафила с ФДЭ5, а также цилостазола с ФДЭ3А и ФДЭ3В соответственно.

Наиболее важными из показанных взаимодействий (рис. 3) являются следующие.

1. Координационный комплекс между ионом магния в активном центре фермента и атомом кислорода хинолиноновой группы.

2. Водородная связь между атомом азота хинолиноновой группы и ASP950.

3. π-π-Стекинговые взаимодействия между TYR751 и фенольным кольцом хинолиновой группы.

Рис. 3. Ключевые молекулярные взаимодействия между цилостазолом и ФДЭ3А.

Наиболее важными из показанных взаимодействий (рис. 4) являются следующие.

1. Водородная связь между GLN 988 и атомами кислорода и азота хинолиноновой группы.

2. π-π-Стекинговые взаимодействия между PHE991 и фенольным кольцом хинолиновой группы.

Рис. 4. Ключевые молекулярные взаимодействия между цилостазолом и ФДЭ3В

Наиболее важными из показанных взаимодействий (рис. 5) являются следующие.

1. Водородная связь между GLN 775 и атомом кислорода хинолиноновой группы.

2. π-π-Стекинговые взаимодействия между PHE820 и фенольным кольцом хинолиновой группы.

Рис. 5. Ключевые молекулярные взаимодействия между цилостазолом и ФДЭ5

Из анализа взаимодействий цилостазола с различными активными центрами ФДЭ можно заключить, что хинолиновый фрагмент молекулы цилостазола представляется ключевым для всех вышеуказанных белково-лигандных взаимодействий. Координационная связь цилостазола с атомом магния в ФДЭ3А объясняет более высокую аффинность цилостазола к этой форме ФДЭ3. Более того, полученные данные по константе ингибирования (Ki) для ФДЭ3A и ФДЭ3В (табл. 1) совпадают с подтвержденными экспериментально, что может служить критерием правильности проведенного докинга и оценки результатов [10]. Рассчитанные константы ингибирования (Ki) ФДЭ5 для цилостазола и варденафила указаны в табл. 2.

Таблица 1. Рассчитанная константа ингибирования ФДЭ3А и ФДЭ3В цилостазолом

Таблица 2. Рассчитанная константа ингибирования ФДЭ5 варденафилом и цилостазолом

Согласно полученным нами данным, цилостазол ингибирует изоформу ФДЭ3A в значительной степени сильнее (Ki=54 nM), чем ФДЭ3B (Ki=1,13µM). Это объясняет низкую частоту побочных эффектов со стороны ингибирования ФДЭ3B при применении цилостазола в клинической практике. Однако мы не можем не отметить, что ФДЭ3В является привлекательной мишенью для лечения сахарного диабета, ожирения и других составляющих метаболического синдрома. Так, мыши, лишенные гена ФДЭ3B (нокаутированные), демонстрируют увеличение мышечной массы и пониженное количество белой жировой ткани, а также повышенный уровень адипонектина в сыворотке крови и усиление секреции инсулина. Это становится благоприятными прогностическими признаками и содействует торможению развитию метаболического синдрома и связанных с ним заболеваний [10]. Более того, изолированные островки поджелудочной железы от мышей с нокаутом ФДЭ3В отличаются усиленной секрецией инсулина, что согласуется со стимулирующими эффектами ингибиторов ФДЭ3.

Важным звеном в патогенезе ожирения, инсулинорезистентности и метаболического синдрома считается воспаление в белой жировой ткани, включающее в себя инфильтрацию и дальнейшую экспансию макрофагов. Ключевое событие, необходимое для развития воспаления в жировой ткани, это активация инфламмасом внутри адипоцитов, что впоследствии приводит к повышению уровня каспазы-1 и процессингу IL1β, способствуя возникновению многих метаболических нарушений, направляющих адипоциты к инсулинорезистентному фенотипу, и оказывая воздействие на развитие воспаления. Ингибирование ФДЭ3В в белой жировой ткани предотвращает активацию инфламмасом за счет снижения экспрессии различных провоспалительных генов, таких как NLRP3, каспазы-1, ASC, AIM2, TNFα, IL1β и др. [11]. Поэтому способность цилостазола как монопрепарата ингибировать не только ФДЭ3А, но и ФДЭ3В обеспечивает мультифакторное воздействие на различные пути патогенеза, связанные с семейством ФДЭ3 при метаболическом синдроме, сахарном диабете, облитерирующих заболеваниях артерий нижних конечностей, ожирении.

Цилостазол также может ингибировать в лечебных дозах ФДЭ5 (Ki=10 µM). Цилостазол таким образом не является строгим ингибитором только семейства ФДЭ3. Достоверно установлено, что ингибиторы ФДЭ5 имеют определенные перспективы в лечении диабетической полиневропатии и, следовательно, СДС. Так, в исследовании L. Wang обнаружено, что продолжительное лечение мышей, больных сахарным диабетом, ингибитором ФДЭ5 (Тадалафил) значительно усиливает разрастание аксонов и миелинизацию седалищного нерва и, как следствие, увеличивает скорость проводимости и сенсорные функции [12]. Лечение ингибитором ФДЭ5, кроме того, заметно увеличивало местный кровоток и плотность функциональных сосудов в седалищном нерве одновременно с увеличением плотности внутриэпидермальных нервных волокон [13]. Можно заключить, что способность цилостазола к ингибированию ФДЭ5 окажет дополнительный терапевтический эффект при лечении перемежающей хромоты, сахарного диабета и его осложнений, в особенности невропатии.

Наряду с указанными лечебными эффектами цилостазола, мы можем прогнозировать развитие у пациентов тех или иных побочных эффектов, связанных с ингибированием семейств ФДЭ3 и ФДЭ5 (табл. 3).

Таблица 3. Побочные эффекты цилостазола, связанные с ингибированием различных семейств ФДЭ

Выводы

1. Цилостазол обладает большей аффинностью к изоформе ФДЭ3А (Ki=54 nM) по сравнению с ФДЭ3В (Ki=1,13 µM) на основе данных проведенного молекулярного докинга.

2. Цилостазол способен ингибировать ФДЭ5 в лечебных дозах (Ki=0 µM).

3. Спрогнозированы потенциальные терапевтические и побочные эффекты применения цилостазола, связанные с новыми молекулярными данными аффинности по отношению к семействам ФДЭ3 и ФДЭ5.

4. Учитывая полученные данные молекулярного исследования, актуально проведение полноценного клинического исследования для регистрации частоты указанных потенциально новых терапевтических и побочных эффектов.

Литература/References

1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 10^th ed. Brussels, Belgium: International Diabetes Federation. 2021.

2. Яковлев А.В., Яковлева О.В., Ситдикова Г.Ф. Учебное пособие. Аденилатциклазная и гуанилатциклазная системы внутриклеточных вторичных посредников. Казань: Издательство КГУ. 2009; 48. [Yakovlev AV, Yakovleva OV, Sitdikova GF. Uchebnoe posobie. Adenilattsiklaznaya i guanilattsiklaznaya sistemy vnutrikletochnykh vtorichnykh posrednikov. Kazan’: Izdatel’stvo KGU. 2009; 48. (In Russ.)]

3. Liras S, Bell AS, Mannhold R, et al. Phosphodiesterases and their inhibitors. Weinheim, Germany: John Wiley & Sons. 2014; 240.

4. Francis SH, Blount MA, Corbin JD. Mammalian cyclic nucleotide phosphodiesterases: molecular mechanisms and physiological functions. Physiol Rev. 2011; 91 (2): 651-690. doi: 10.1152/physrev.00030.2010

5. Sun B, Li H, Shakur Y, et al. Role of phosphodiesterase type 3A and 3B in regulating platelet and cardiac function using subtype-selective knockout mice. Cell Signal. 2007; 19: 1765-1771. doi: 10.1016/j.cellsig.2007.03.012

6. Kilanowska A, Ziółkowska A. Role of phosphodiesterase in the biology and pathology of diabetes. Int J Mol Sci. 2020; 21 (21): 8244. doi: 10.3390/ijms21218244

7. Friesner RA, Murphy RB, Repasky MP, et al. Extra precision glide: docking and scoring incorporating a model of hydrophobic enclosure for protein-ligand complexes. J Med Chem. 2006; 49 (21): 6177-6196. doi: 10.1021/jm051256o

8. Berendsen HJC, van der Spoel D, van Drunen R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Comp Phys Comm. 1995; 91 (1-3): 43-56. doi: 10.1016/0010-4655(95)00042-E

9. Atkins PW, Paula JC. Physical chemistry. Oxford: Oxford University Press. 2006; 944.

10. Maurice DH, Ke H, Ahmad F, et al. Advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases. Nat Rev Drug Discov. 2014; 13 (4): 290-314. doi: 10.1038/nrd4228

11. Ahmad F, Chung YW, Tang Y, et al. Phosphodiesterase 3B (PDE3B) regulates NLRP3 inflammasome in adipose tissue. Sci Rep. 2016; 6: 28056. doi: 10.1038/srep28056

12. Wang L, Chopp M, Zhang ZG. PDE5 inhibitors promote recovery of peripheral neuropathy in diabetic mice. Neural Regen Res. 2017; 12 (2): 218-219. doi: 10.4103/1673-5374.200804

13. Bender AT, Beavo JA. Cyclic nucleotide phosphodiesterases: molecular regulation to clinical use. Pharmacol Rev. 2006; 58 (3): 488-520. doi: 10.1124/pr.58.3.5

14. Yan C, Miller CL, Abe J. Regulation of phosphodiesterase 3 and inducible cAMP early repressor in the heart. Circ Res. 2007; 100 (4): 489-501. doi: 10.1161/01.RES.0000258451. 44949.d7

15. Polidovitch N, Yang S, Sun H, et al. Phosphodiesterase type 3A (PDE3A), but not type 3B (PDE3B), contributes to the adverse cardiac remodeling induced by pressure overload. J Mol Cell Cardiol. 2019; 132: 60-70. doi: 10.1016/j.yjmcc.2019.04.028

16. Kherallah RY, Khawaja M, Olson M, et al. Cilostazol: a review of basic mechanisms and clinical uses. Cardiovasc Drugs Ther. 2021. doi: 10.1007/s10557-021-07187-x

17. Wise SK, Lin SY, Toskala E, et al. International consensus statement on allergy and rhinology: allergic rhinitis. Int Forum Allergy Rhinol. 2018; 8 (2): 108-352. doi: 10.1002/alr.22073

18. Conti M. Phosphodiesterases and regulation of female reproductive function. Curr Opin Pharmacol. 2011; 11: 665-669.

19. Chapman TM, Goa KL. Cilostazol: a review of its use in intermittent claudication. Am J Cardiovasc Drugs. 2003; 3 (2): 117-138. doi: 10.2165/00129784-200303020-00006

20. Arroyo A, Kim B, Yeh J. Luteinizing hormone action in human oocyte maturation and quality: signaling pathways, regulation, and clinical impact. Reprod Sci. 2020; 27 (6): 1223-1252. doi: 10.1007/s43032-019-00137-x

21. Härndahl L, Wierup N, Enerbäck S, et al. Beta-cell-targeted overexpression of phosphodiesterase 3B in mice causes impaired insulin secretion, glucose intolerance, and deranged islet morphology. J Biol Chem. 2004; 279 (15): 15214-15222. doi: 10.1074/jbc.M3089 52200

22. Hsieh CJ, Wang PW. Effect of cilostazol treatment on adiponectin and soluble CD40 ligand levels in diabetic patients with peripheral arterial occlusion disease. Circ J. 2009; 73 (5): 948-954. doi: 10.1253/circj.cj-08-0905

23. Andersson KE. PDE5 inhibitors - pharmacology and clinical applications 20 years after sildenafil discovery. Br J Pharmacol. 2018; 175 (13): 2554-2565. doi: 10.1111/bph.14205

24. Padda IS, Tripp J. Phosphodiesterase Inhibitors. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021.