Полиморфизм rs7692387 гена GUCY1A1 - генетический маркер развития облитерирующего атеросклероза у курильщиков

• Жабин С.Н.
• Лазаренко В.А.
• Черноусова С.С.
• Башкатов Д.А.
• Азарова Ю.Э.
• Клёсова Е.Ю.
• Быканова М.А.
• Полоников А.В.

Резюме

Полиморфные варианты гена GUCY1A1 (a-субъединица 1 гуанилатциклазы I типа) ассоциированы с предрасположенностью к ишемической болезни сердца и артериальной гипертензии. Однако остается неисследованной связь полиморфизма данного гена с риском развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей.

Цель пилотного исследования - изучение связи полиморфных вариантов rs7692387 и rs13139571 гена GUCY1A1 с риском развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей. В исследование вошли 1277 неродственных индивидов славянского происхождения, среди которых были 629 больных облитерирующим атеросклерозом и 648 относительно здоровых добровольцев. Генотипирование полиморфизмов проводилось с использованием геномного масс-спектрометра MassARRAY-4. Установлено, что аллель rs7692387-A (OR=1,42, 95% CI 1,17-1,74, р=0,0005) и генотипы rs7692387-G/A-A/A (OR=1,77, 95% CI 1,28-2,44, р=0,0005) ассоциированы с повышенным риском облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей независимо от пола, возраста, индекса массы тела, наличия у пациентов ишемической болезни сердца и артериальной гипертензии. Кроме того, гаплотип rs7692387A-rs13139571A (OR=1,52, 95% CI 1,17-1,98, р=0,002) был ассоциирован с повышенным риском, а гаплотип rs7692387G-rs13139571A (OR=0,26, 95% CI 0,12-0,58, р=0,0009), наоборот, обладал защитным эффектом в отношении риска развития болезни. Выявленные ассоциации аллелей, генотипов и гаплотипов GUCY1A1 наблюдались исключительно у курильщиков. Биоинформатический анализ показал, что ассоциированный с болезнью полиморфизм rs7692387 является функционально значимым вариантом, связанным с повышением экспрессии гена GUCY1A1, а также мишенью для эпигенетической регуляции экспрессии гена, в том числе под влиянием компонентов табачного дыма. Таким образом, полиморфизм rs7692387 гена GUCY1A1 может представлять собой новый генетический вариант, посредством которого курение как ведущий фактор риска развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей негативно влияет на формирование болезни.

Ключевые слова:облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей; генетическая предрасположенность; гуанилатциклаза; ген GUCY1A1; однонуклеотидный полиморфизм; курение

Введение

Облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей (ОААНК) относят к системным хроническим заболеваниям артерий обменно-дистрофического характера, при котором ремоделирование артериальной стенки происходит в результате разрастания соединительной ткани с сопутствующей липидной инфильтрацией интимы, стенозированием просвета сосуда и развитием ишемии нижних конечностей [1]. Несмотря на то что за последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в хирургическом лечении пациентов с атеросклерозом, остается нерешенной проблема ранней диагностики заболевания. Это связано с отсутствием клинически значимых маркеров для прогнозирования риска развития и течения болезни, которые способствовали бы внедрению персонализированных подходов к ее лечению и профилактике [2].

Согласно современным представлениям, ОААНК - это мультифакториальное заболевание, развитие которого определяется взаимодействием генетических и средовых факторов [3]. Достижения в области геномных технологий позволили установить широкий спектр полиморфных вариантов генов, которые, с одной стороны, имеют этиологическое значение для ОААНК, с другой - могут использоваться для прогнозирования риска и исходов заболевания с последующей оптимизацией и персонализацией его профилактики и лечения [3]. По данным GWAS Catalog, в мире выполнено 5 крупных полногеномных ассоциативных исследований (GWAS, Genome-Wide Association Study) при заболеваниях периферических артерий, в результате которых установлены 14 локусов в области генов EDNRA, CSMD3, HDAC9, ATXN2, MAPK10, PCAT14, MIR4675, OSBPL10, FRMD4A, LRBA, TGFB2 и MTND4LP25, ассоциированных с предрасположенностью к болезни у представителей различных рас и этносов [4]. Значительно большее число GWAS проведено при коронарном и церебральном атеросклерозе, что позволило выявить тысячи патогенетически значимых для атерогенеза полиморфных вариантов, многие из которых до сих пор не были исследованы при ОААНК как в России, так и за рубежом. Одним из таких генов является GUCY1A1 (guanylate cyclase 1 soluble subunit alpha 1), который кодирует растворимую a-субъединицу 1 гуанилатциклазы I типа, чувствительную к оксиду азота (NO). Растворимая гуанилатциклаза функционирует как рецептор для NO и нитровазодилататоров, сигналы от которых передаются в клетку посредством превращения гуанозинтрифосфата (ГТФ) во вторичный мессенджер циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), что, в свою очередь, приводит к разнообразным физиологическим эффектам, в том числе и в клетках артерий [5]. Хорошо известно, что полиморфизмы гена GUCY1A1 связаны с развитием болезни моя-моя, характеризующейся двусторонним стенозом интракраниальных сонных артерий и телеангиэктазиями в области базальных ганглиев [6]. В зарубежной литературе существуют данные, указывающие на связь между полиморфизмом гена GUCY1A1 и риском развития сердечно-сосудистых заболеваний - коронарного атеросклероза и артериальной гипертензии [7, 8]. В этой связи изучение роли полиморфизма гена GUCY1A1 в развитии различных формах атеросклероза на сегодняшний день представляется актуальным. Однако до настоящего времени исследований, направленных на поиск ассоциаций однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP) гена GUCY1A1 с риском развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей, не проводилось. Таким образом, целью настоящего пилотного исследования было изучение связи полиморфных вариантов гена GUCY1A1 с риском развития ОААНК.

Материал и методы

Все пациенты, включенные в исследование, подписали информированное согласие на участие. Протокол исследования (протокол № 9, от 2013 г.) был утвержден региональным этическим комитетом Курского государственного медицинского университета (КГМУ). В исследование были включены 1277 неродственных индивидов славянского происхождения, среди которых были 629 больных ОААНК и 648 относительно здоровых добровольцев без хронических заболеваний, обследованных в рамках проведения предыдущих исследований [9]. Пациенты с ОААНК находились на стационарном лечении в отделениях хирургии КГМУ Курской областной клинической больницы. Диагноз ОААНК устанавливался на основании Национальных клинических рекомендаций по диагностике и лечению заболеваний артерий нижних конечностей (Москва, 2019). Всем пациентам выполняли дуплексное сканирование и ангиографию нижних конечностей. Исследование коронарных и брахиоцефальных артерий пациентам ОААНК не проводилось. С помощью анкетирования у пациентов исследования были собраны анамнестические данные о наличии сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний, а также сведения о курении.

У всех пациентов из локтевой вены забирали по 5 мл крови, из которой выделяли геномную ДНК стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции и преципитации этанолом. Для исследования было отобрано 2 полиморфных варианта rs7692387 и rs13139571 гена GUCY1A1, которые показали ассоциации с сердечно-сосудистыми заболеваниями в результате полногеномных исследований [10, 11]. Генотипирование полиморфизмов проводилось на базе Научно-исследовательского института генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ с использованием время-пролетного геномного масс-спектрометра MassARRAY-4 (Agena Bioscience, США). Ассоциации аллелей, генотипов и гаплотипов GUCY1A1 с риском развития ОААНК анализировались посредством статистической программы SNPStats (https://www.snpstats.net/start.htm). Статистический анализ клинических и лабораторных характеристик проводился с помощью программы STATISTICA 13.3 (TIBCO Software Inc., США). Функциональное аннотирование SNP осуществлялось с использованием биоинформатических ресурсов GTEx portal (https://gtexportal.org), QTLbase (http://www.mulinlab.org/qtlbase/index.html) и HaploReg v4.1 (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php).

Результаты

В табл. 1 представлены клинические и лабораторные характеристики участников исследования. В сравнении с контрольной группой у больных ОААНК (основная группа) средний возраст был выше (р=0,001), количество мужчин было существенно больше (р<0,0001). Более 58% пациентов с ОААНК страдали артериальной гипертензией (АГ), 30% - ишемической болезнью сердца (ИБС). В группе больных ОААНК не было пациентов, перенесших в анамнезе нарушения мозгового кровообращения. У 258 (40,31%) пациентов основной группы наблюдался отягощенный наследственный анамнез по облитерирующим заболеваниям артерий нижних конечностей.

Таблица 1. Клинические и лабораторные характеристики участников исследования

Примечание. M ‒ среднее значение; SD ‒ стандартное отклонение; Me - медиана; [Q1; Q3] ‒ первый и третий квартили.

В общей выборке пациентов (p=0,12) частоты генотипов SNP rs7692387 находились в равновесии Харди-Вайнберга (РХВ), тогда как в отношении SNP rs13139571 наблюдалось отклонение частот генотипов от РХВ только в группе больных ОААНК (р=0,007). В табл. 2 представлены частоты аллелей и генотипов в исследуемых группах. Проведено сравнение частот минорных аллелей (MAF) между исследуемой российской популяцией и популяциями 3-й фазы проекта "1000 геномов" (данные Ensembl, http://grch37.ensembl.org/index.html) [12]. Установлено, что MAF rs7692387 (0,193) и rs13139571 (0,234) гена GUCY1A1 в исследуемой нами выборке статистически значимо (p<0,0001) отличаются от африканской популяции: 0,054 и 0,129 соответственно. В то же время частоты минорных аллелей исследуемых полиморфизмов были сопоставимы с таковыми в других популяциях мира (p>0,05).

Таблица 2. Ассоциации полиморфных вариантов гена GUCY1A1 с развитием облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей (ОААНК) в общей группе в зависимости от фактора риска - курения

Примечание. ¹ - уровень значимости ассоциации аллеля/генотипа GUCY1A1 с риском развития ОААНК (кодоминантная генетическая модель); ² - отношение шансов и 95% доверительный интервал ассоциации с риском развития ОААНК с коррекцией по полу, возрасту, индексу массы тела; наличию коморбидных сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь).

Как видно из табл. 2, SNP rs7692387 статистически значимо ассоциировался с повышенным риском развития ОААНК (p=0,0019), независимо от пола, возраста, индекса массы тела (ИМТ), а также сопутствующей сердечно-сосудистой патологии (ИБС и АГ). В частности, аллель rs7692387-A (OR=1,42, 95% CI 1,17-1,74, p=0,0005) и генотипы rs7692387-G/A-A/A (OR=1,77, 95% CI 1,28-2,44, p=0,0005, доминантный эффект полиморфизма) были ассоциированы с повышенным риском развития болезни. Статистически значимых различий в частотах аллеля и генотипов rs13139571 между группами больных ОААНК и контроля не было установлено. Был проведен анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена GUCY1A1 с развитием ОААНК в группах, стратифицированных по основному фактору риска развития болезни - курению. Оказалось, что SNP rs7692387 ассоциируется с повышенным риском развития ОААНК исключительно у курильщиков и характеризуется нейтральным эффектом на возникновение болезни у некурящих индивидов.

В табл. 3 представлены результаты анализа гаплотипов гена GUCY1A1. Установлено 4 гаплотипа GUCY1A1, 2 из которых (H2 и H3) ассоциировались с развитием ОААНК у курильщиков (р_Haplotype<0,0001). В частности, гаплотип H2 (rs7692387A-rs13139571A) был ассоциирован с повышенным риском ОААНК, тогда как гаплотип H3 (rs7692387G-rs13139571A), наоборот, обладал защитным эффектов в отношении риска развития болезни даже у курящих индивидов. Ассоциации гаплотипов гена GUCY1A1 с развитием ОААНК у курильщиков не зависели от пола, возраста, ИМТ, а также сопутствующих заболеваний и диабета. Полиморфные варианты rs7692387 и rs13139571 находились в сильном положительном неравновесии по сцеплению друг с другом (D’=0.960, p<0,0001).

Таблица 3. Анализ ассоциаций гаплотипов гена GUCY1A1 c риском развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей (ОААНК)

Примечание. ¹ - уровень значимости ассоциации гаплотипа GUCY1A1 с риском развития ОААНК; ² - отношение шансов и 95% доверительный интервал ассоциации гаплотипа с риском развития ОААНК с коррекцией по полу, возрасту, индексу массы тела, наличию коморбидных сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь).

С целью патофизиологической интерпретации выявленных генно-фенотипических взаимосвязей проведено функциональное аннотирование (in silico) полиморфного варианта rs7692387 гена GUCY1A1 с использованием различных биоинформатических инструментов и ресурсов. Оба исследуемых SNP расположены в интронных областях гена и поэтому не могут оказывать влияния на аминокислотный состав белка GUCY1A1. Согласно геномно-транскриптомным данным портала проекта GTEx (https://gtexportal.org), было установлено, что аллель rs7692387-A, ассоциированный с развитием ОААНК, статистически значимо связан с повышением уровня экспрессии генов GUCY1A1 (р=5,6×10^-8) и GUCY1B3 (p=0,000018) в большеберцовой артерии [13]. Кроме того, с помощью биоинформатических инструментов портала QTLbase (http://www.mulinlab.org/qtlbase/index.html) было предсказано (р=1,81×10^-5), что SNP rs7692387 представляет собой функционально значимый участок ДНК, связанный с образованием тканеспецифического (в большеберцовой артерии) сайта альтернативного полиаденилирования (так называемого apaQTL, alternative polyadenylation quantitative trait locus) в 3’-нетранлируемой области гена GUCY1A1. Посредством ресурса HaploReg было предсказано, что SNP rs7692387 гена GUCY1A1 также представляет собой участок аллель-специфического связывания транскрипционных факторов, таких как BCL, E2F, IRF, NANOG, POU2F2, POU5F1, RXRA, STAT и Sox, которые способны модулировать экспрессию гена.

Обсуждение

В рамках настоящего исследования впервые была изучена связь полиморфных вариантов гена GUCY1A1 с риском развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей. Установлено, что полиморфный вариант rs7692387 гена GUCY1A1 статистически значимо оказался ассоциирован с предрасположенностью курильщиков к развитию ОААНК независимо от пола, возраста, ИМТ и сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний. Таким образом, SNP rs7692387 гена GUCY1A1 может представлять собой новый генетический вариант, посредством которого курение как ведущий фактор риска развития ОААНК реализует свое негативное влияние на формирование болезни.

Ген GUCY1A1 кодирует субъединицу α₁ растворимой гуанилатциклазы, которая катализирует превращение ГТФ в цГМФ, что вызывает вазодилатацию и ингибирует активацию тромбоцитов, являющихся ключевыми участниками связанных с атеросклерозом механизмов регуляции сосудистого тонуса и гемостаза [7, 14-16]. GUCY1A1 играет ключевую роль в передаче внутрь клеток сигналов от оксида азота, антиатерогенные эффекты которого реализуются посредством многочисленных механизмов, включая подавление пролиферации и миграции гладкомышечных клеток, эндотелиальной дисфункции, агрегации тромбоцитов, а также адгезии лейкоцитов, тем самым снижая воспаление и утолщение стенки артерий [14, 16, 17].

Ключевой находкой был тот факт, что связь SNP rs7692387 гена GUCY1A1 с повышенным риском развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей проявлялась исключительно у курильщиков. Механизмы, посредством которых курение патофизиологически связано с развитием атеросклероза, хорошо изучены и включают активацию окислительного стресса и воспалительных изменений в сосудах и развитие эндотелиальной дисфункции, снижение выработки или биодоступности NO, окисление холестерина липопротеинов низкой плотности и их депонирование в стенку артерий, ремоделирование клеток гладкой мускулатуры и фенотипическую трансформацию макрофагов, а также активацию свертывающей системы крови и тромбообразование [18, 19].

В литературе имеются противоречивые данные о направленности изменений в экспрессии или активности гена GUCY1A1 в отношении риска развитии атеросклероза. Так, в экспериментальном исследовании Segura-Puimedon и соавт. (2016), выполненном на мышах, установлено, что именно потеря функции GUCY1A1 проявлялась протективным эффектом в отношении развития атеросклероза у предрасположенных к нему мышей [14]. В этой связи полученные нами результаты согласуются с результатами этого экспериментального исследования. В то же время высказывалось альтернативное мнение о том, что именно повышенный уровень экспрессии гена GUCY1A1 связан со снижением риска развития атеросклероза [7]. Согласно геномно-транскриптомным данным портала GTEx носители вариантного аллеля rs7692387-A, который ассоциирован с развитием ОААНК у курильщиков, связаны с повышением уровня экспрессии гена GUCY1A1 в большеберцовой артерии [13]. Точная патофизиологическая интерпретация выявленных взаимосвязей не представляется возможной, так как в литературе отсутствуют исследования, доказывающие корреляции высокого уровня экспрессии гена GUCY1A1 с повышением риска развития ОААНК. Однако можно предположить, что дефицит оксида азота (агонист гуанилатциклазы), уровень которого существенно снижается у курильщиков под влиянием токсичных компонентов табачного дыма, может быть ответственным за уменьшение модуляции рецептора GUCY1A1 и, как следствие, образования цГМФ и его антиатерогенных эффектов [18].

Остается открытым вопрос, почему этот предполагаемый механизм свойствен для носителей аллеля rs7692387-A? Интересной находкой было то, что SNP rs7692387 представляет собой регуляторный участок ДНК - сайт альтернативного полиаденилирования, который может использоваться для контроля экспрессии гена GUCY1A1 в большеберцовой артерии [20]. Как известно, в результате альтернативного полиаденилирования могут образовываться транскрипты с различными физико-химическими свойствами, которые способны оказывать влияние на степень созревания мРНК и их стабильность, приводить к избыточному распаду клеточной РНК, что в результате скажется на конечном уровне РНК-транскрипта [21]. Другими потенциальными механизмами, посредством которых может изменяться экспрессия гена GUCY1A1 под влиянием компонентов табачного дыма, служат аллель-специфическое связывание транскрипционных факторов, тканеспецифическая эпигенетическая регуляция посредством метилирования ДНК и модификации гистонов, как это было ранее показано в отношении гена GUCY1A1 [22, 23]. Однако данные предположения обязывают проведение дополнительных экспериментальные исследований, которые могли бы объяснить молекулярные механизмы, посредством которых полиморфные варианты гена GUCY1A1 вовлечены в патогенез ОААНК.

Заключение

Полиморфизм rs7692387 гена GUCY1A1 может представлять собой новый генетический вариант, посредством которого курение как ведущий фактор риска развития ОААНК реализует свое негативное влияние на возникновение болезни.

Литература

1. Калинин Р.Е., Сучков И.А., Чобанян А.А. и др. Маркеры течения облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей. Ангиология и сосудистая хирургия. 2021; 27 (2): 17-23. DOI: https://doi.org/10.33529/ANGIO2021203

2. Zhang R., Lai Z.C., Liu C.W. Femoral-popliteal Arteriosclerosis Obliterans: Review of Evidence-based Studies on Drug-eluting Endovascular Treatment. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. Acta Academiae Medicinae Sinicae. 2019; 41 (2): 256-260. DOI: https://doi.org/10.3881/j.issn.1000-503X.10849. (In Chinese)

3. Klarin D., Tsao P.S., Damrauer S.M. Genetic Determinants of Peripheral Artery Disease. Circulation Research. 2021; 128 (12): 1805-1817. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.121.318327

4. GWAS Catalog [Электронный ресурс]. URL: https://www.ebi.ac.uk/gwas/home (дата обращения 15.02.2022)

5. Wittenborn E.C., Marletta M.A. Structural Perspectives on the Mechanism of Soluble Guanylate Cyclase Activation. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22 (11): 5439. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22115439

6. Mineharu Y., Miyamoto S. RNF213 and GUCY1A3 in Moyamoya Disease: Key Regulators of Metabolism, Inflammation, and Vascular Stability. Frontiers in Neurology. 2021; 12: 687088. DOI: https://doi.org/10.3389/fneur.2021.687088

7. Kessler T., Wobst J., Wolf B., et al. Functional Characterization of the GUCY1A3 Coronary Artery Disease Risk Locus. Circulation. 2017; 136 (5): 476-489. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.116.024152

8. Wallace S., Guo D.C., Regalado E., et al. Disrupted nitric oxide signaling due to GUCY1A3 mutations increases risk for moyamoya disease, achalasia and hypertension. Clinical Genetics. 2016; 90 (4): 351-360. DOI: https://doi.org/10.1111/cge.12739

9. Азарова Ю.Э., Клёсова Е.Ю., Сакали С.Ю., Ковалёв А.П. Вклад полиморфизма rs11927381 гена IGF2BP2 в патогенез сахарного диабета 2 типа. Научные результаты биомедицинских исследований. 2020; 6 (1): 9-19. DOI: https://doi.org/10.18413/2658-6533-2020-6-1-0-2

10. Van der Harst P., Verweij N. Identification of 64 Novel Genetic Loci Provides an Expanded View on the Genetic Architecture of Coronary Artery Disease. Circulation Research. 2018; 122 (3): 433-443. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.117.312086

11. Sung Y.J., Winkler T.W., de Las Fuentes L., et al. A Large-Scale Multi-ancestry Genome-wide Study Accounting for Smoking Behavior Identifies Multiple Significant Loci for Blood Pressure. American Journal of Human Genetics. 2018; 102 (3): 375-400. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2018.01.015

12. Ensembl Genome Browser [Электронный ресурс]. URL: http://grch37.ensembl.org/index.html (дата обращения 15.02.2022)

13. GTEx Portal [Электронный ресурс]. URL: https://gtexportal.org/home (дата обращения 15.02.2022)

14. Segura-Puimedon M., Mergia E., Al-Hasani J., et al. Proatherosclerotic Effect of the α1-Subunit of Soluble Guanylyl Cyclase by Promoting Smooth Muscle Phenotypic Switching. American Journal of Pathology. 2016; 186 (8): 2220-2231. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2016.04.010

15. Hall K.T., Kessler T., Buring J.E., et al. Genetic variation at the coronary artery disease risk locus GUCY1A3 modifies cardiovascular disease prevention effects of aspirin. European Heart Journal. 2019; 40 (41): 3385-3392. DOI: https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehz384

16. Nording H., Baron L., Langer H.F. Platelets as therapeutic targets to prevent atherosclerosis. Atherosclerosis. 2020; 307: 97-108. DOI: https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2020.05.018

17. Hervé D., Philippi A., Belbouab R., et al. Loss of α1β1 soluble guanylate cyclase, the major nitric oxide receptor, leads to moyamoya and achalasia. American Journal of Human Genetics. 2014; 94 (3): 385-94. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2014.01.018

18. Ambrose J.A., Barua R.S. The pathophysiology of cigarette smoking and cardiovascular disease: an update. Journal of the American College of Cardiology. 2004; 43 (10): 1731-1737. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jacc.2003.12.047

19. Wang W., Zhao T., Geng K., et al. Smoking and the Pathophysiology of Peripheral Artery Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 2021; 8: 704106. DOI: https://doi.org/10.3389/fcvm.2021.704106

20. GTEx Consortium. Human genomics. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) pilot analysis: multitissue gene regulation in humans. Science. 2015; 348 (6235): 648-660. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1262110

21. Di Giammartino D.C., Nishida K., Manley J.L. Mechanisms and consequences of alternative polyadenylation. Molecular Cell. 2011; 43 (6): 853-866. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2011.08.017

22. Jiang C.L., He S.W., Zhang Y.D., et al. Air pollution and DNA methylation alterations in lung cancer: A systematic and comparative study. Oncotarget. 2017; 8 (1): 1369-1391. DOI: https://doi.org/10.18632/oncotarget.13622

23. Xiong R., Wu Y., Wu Q., et al. Integration of transcriptome analysis with pathophysiological endpoints to evaluate cigarette smoke toxicity in an in vitro human airway tissue model. Archives of Toxicology. 2021; 95 (5): 1739-1761. DOI: https://doi.org/10.1007/s00204-021-03008-0